（一）酵母菌的分離

　　1．分離原理

　　在液體中，酵母菌的生長比霉菌快；酵母菌比細(xì)菌喜酸，適于酸性培養(yǎng)基；細(xì)菌對抗生素敏感，而酵母菌對抗生素不敏感。利用上述特性，可先降低大曲中的霉菌和細(xì)菌數(shù)量，使酵母菌占優(yōu)勢，再從中分離出酵母菌。

　　2．實驗材料

　　固體曲，含0. 5%乳酸的酸性麥芽汁培養(yǎng)基試管，固體鏈霉素麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

　　3．操作

　　可采用平板劃線分離，也可采用稀釋平板法分離。

　　（二）根霉的分離

　　大曲中的根霉一般呈菌絲和孢子狀態(tài)，蔓延繁殖在曲塊中，而曲塊本身結(jié)合得較緊密，所以由大曲直接稀釋分離往往得不到理想的結(jié)果。為了保證分離到根霉，一般先選擇一種培養(yǎng)基進行預(yù)培養(yǎng)，待長出菌絲和孢子囊后，再進行稀釋分離和純化。

　　1．根霉的分離

　　用酒精消毒研缽，放人大曲研磨至細(xì)。取少許大曲粉撒在饅頭上，在28℃下培養(yǎng)l~2d，待饅頭上長出菌絲和孢子囊后，挑取有代表性的根霉，接種到豆芽汁葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3d，長成孢子囊后進行純化。

　　2．根霉的純化

　　上述分離得到的根霉一般不是純種，需要進一步純化。

　　用接種針挑取一小叢帶幾個孢子囊的菌絲，放入裝有l(wèi)OmL無菌水的第1試管中，打勻。再用接種環(huán)取1環(huán)至裝有l(wèi)OmL無菌水的第2試管中，搖勻。由第2試管取ImL加入至第3試管（裝有l(wèi)OmL無菌水）中。分別由第1試管、第2試管和第3試管中取0.5mL，接種到豆芽汁葡萄糖瓊脂平板上。用玻璃刮刀刮平，28C培養(yǎng)17—18h。最后，接出單菌落于豆芽汁葡萄糖斜面上。若不純，則再進行純化。

　　若有條件，應(yīng)進行根霉鑒定。一般根霉只要從培養(yǎng)特征和形態(tài)觀察即可確定到屬。

　　（三）曲霉菌的分離培養(yǎng)

　　曲霉菌的分離，不必像根霉那樣需進行預(yù)培養(yǎng)，可直接用稀釋法進行分離；黃曲霉可用察氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)；黑曲霉可用馬丁培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。

　　在培養(yǎng)基中加入0.1%鏈霉素或結(jié)晶紫，可抑制細(xì)菌的生長。

　　（四）窖泥微生物的分離

　　1．窖泥中己酸菌的分離

　　己酸菌為嫌氣芽孢桿菌，分離前應(yīng)先把樣品進行熱處理，殺死其營養(yǎng)體和非芽孢桿菌，再采用厭氧培養(yǎng)，反復(fù)純化，即可獲得純菌種。

　　富集培養(yǎng)基：乙醇25mL，乙酸鈉8g，MgCl2 0.2g，NH4 Cl 0.5g，MnSO4 0.0025g，CaSO4 0.Olg，F(xiàn)eSO4 0.005g，Na2MoO4 0.0025g，生物素5μg，對氨基苯甲酸100μg，pH7.0的Imol磷酸二氫鉀一磷酸氫二鈉25mL，含1%的硫化鈉和0.05%碳酸鈉溶液20mL。加蒸餾水到975mL。除乙醇外的其他成分混合后滅菌，乙醇在使用前單獨加入。

　　分離用培養(yǎng)基：KH2PO4 0.04%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCO31%，乙酸鈉0.5%，硫酸銨0. 05%，酵母膏0.1%，乙醇2%，pH7.0。除乙醇外的其他成分混合后滅菌，乙醇在使用前單獨加入。

　　操作方法：取樣品窖泥5g置于裝有45mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩20min。靜置5min后，逐級稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5不同濃度的菌懸液。取10-4~10-5濃度的茵懸液進行熱處理(1Omin，80℃)。處理后的菌懸液用上述富集培養(yǎng)基培養(yǎng)7—8d至產(chǎn)氣。然后挑取產(chǎn)氣正常的試管轉(zhuǎn)入新鮮富集培養(yǎng)液中培養(yǎng)7～1Od。根據(jù)鏡檢及己酸顯色反應(yīng)結(jié)果，選取產(chǎn)己酸的富集培養(yǎng)試樣。將試樣富集液80℃熱處理5 min后，再用無菌水稀釋至10-4~10-5，吸取不同濃度的稀釋液進行平板分離，置于真空干燥器內(nèi)(真空度80kPa)，35℃培養(yǎng)5d。挑取分離良好的單菌落，轉(zhuǎn)移到試管富集培養(yǎng)基中，在真空條件下培養(yǎng)7d，選取產(chǎn)氣試管，測定產(chǎn)己酸的量，將產(chǎn)己酸高者進行鏡檢，觀察菌體形態(tài)一致者，可作為初篩菌。在初篩菌株中，選取產(chǎn)己酸量較高的菌株編號，并反復(fù)進行純化，在確認(rèn)為純種后，再進行鑒定、保存。

　　己酸菌的形態(tài)特征是：長桿菌，單個存在，菌體大小為(0.8~1.0)μm×(3.0~5.0)μm；在固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48h后，芽孢端生（芽孢發(fā)育開始為近端生），芽孢呈圓形、橢圓形或膨大為梭狀，周生鞭毛，兼性厭氣，革蘭陰性，固體深層菌落灰白色，邊緣整齊。

　　2．窖泥中丁酸菌的分離

　　丁酸菌的分離原理與己酸菌基本相同，但丁酸菌的分離、富集培養(yǎng)基與己酸菌不同。

　　所用培養(yǎng)基如下：

　　富集培養(yǎng)基：牛肉膏15g，蛋白胨20g，葡萄糖30g，碳酸鈣20g，蒸餾水lOOOmL，pH7.0。

　　分離培養(yǎng)基：牛肉膏l(xiāng)Og，葡萄糖50g，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH7.0。

　　操作方法：分離時采用平板劃線分離，平板置于真空干燥器內(nèi)（真空度為80kPa），33~35℃培養(yǎng)3d后，單菌落接種于富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到產(chǎn)氣為止。

　　丁酸菌在顯微鏡下為鼓槌狀芽孢桿菌，長3.0μm，寬0.8μm。用碘液染色呈藍(lán)色，而己酸菌不呈色，可據(jù)此特性區(qū)分丁酸菌和己酸菌。

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